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單層貼壁細胞總蛋白的提取
日期：2024-09-20 04:44
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摘要：單層貼壁細胞總蛋白的提?。? 1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2.每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）
4.每瓶細胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細胞充分裂...
單層貼壁細胞總蛋白的提取：
1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2.每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）
4.每瓶細胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。
5.裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）
6.于 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。（提前開離心機預(yù)冷）
7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 1.5 ml 的離心管中放于-20℃ 保存。
（個人感覺上述方法可操作性有待加強，細胞中蛋白本來就很少，一瓶 T-75的細胞有時按照實驗要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液進行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。）
（注：先用預(yù)冷的PBS（一般數(shù)毫升）加入后，清洗2次，加1ml PBS用細胞刮刮下細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 ml 的離心管中，離心得細胞，加裂解液冰上裂解30分鐘期間震蕩數(shù)次，離心，超聲裂解，離心，取上清）
1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2.每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）
4.每瓶細胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。
5.裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）
6.于 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。（提前開離心機預(yù)冷）
7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 1.5 ml 的離心管中放于-20℃ 保存。
（個人感覺上述方法可操作性有待加強，細胞中蛋白本來就很少，一瓶 T-75的細胞有時按照實驗要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液進行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。）
（注：先用預(yù)冷的PBS（一般數(shù)毫升）加入后，清洗2次，加1ml PBS用細胞刮刮下細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 ml 的離心管中，離心得細胞，加裂解液冰上裂解30分鐘期間震蕩數(shù)次，離心，超聲裂解，離心，取上清）