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Rt-qPCR反應條件的控制
日期：2024-09-20 01:09
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摘要：
實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
PCR反應條件的控制：
1. PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100...
實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
PCR反應條件的控制：
1. PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反應溫度
（1）變性溫度和時間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時間72℃，1 min/kb(10 kb內）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期"。