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細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

主要功能：

（1）血管平滑肌細(xì)胞的再生能力是原發(fā)血管病變的重要因素。

（2）表達(dá)鈣通道及ICAM-1和VCAM-1，參與血管壁的炎癥反應(yīng)。

（3）與血管的進(jìn)展和穩(wěn)定有關(guān)。

 生理變化：

（1）主動(dòng)脈硬化。

（2）主動(dòng)脈瘤

（3）主動(dòng)脈鈣化。

基本特性：

（1）組織來源于正常大鼠大動(dòng)脈組織。

（2）鑒定：肌動(dòng)蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色。

（3）原代細(xì)胞培養(yǎng)末期液氮凍存。

（4）每凍存管細(xì)胞數(shù)：>5×105 cells/1ml。

（5）肌動(dòng)蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色驗(yàn)證。

（6）不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原體、酵母。

培養(yǎng)步驟：

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞|細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

DNA電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)系列（DNA marker）（λDNA/EcoR I）　Haemophilus medium

pPGKNeo　pBR313

Blotto in TBS with azide　人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體3(VEGFR-3/Flt-4)ELISA Kit

大鼠胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)ELISA Kit　柱式動(dòng)物線粒體DNAout，PCR

Marinitoga litoralis medium　pMMB208

pcDNA4/HisMax C(pcDNA4HisMaxC)　戊二醛（0.1M 磷酸緩沖液，pH7.4）溶液，2.5%

人中粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)ELISA Kit　大鼠Ⅲ型前膠原肽(PⅢNP)ELISA Kit

植物DNAout　Bennett's agar

pOSCAR　pAB366Ben

Nassar Sha nklin 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色法神經(jīng)組織染色試劑盒

大鼠骨形成蛋白6(BMP-6)ELISA Kit　小鼠甲狀腺素(T4)ELISA Kit

Deferribacter thermophilus medium　預(yù)混型丙烯酰胺-甲叉雙丙烯干粉（29：1）

pARO191　pSico PGK puro(pSicoPGKpuro)

兔腦膜細(xì)胞安格洛苷C 英文名稱：Angelo glycoside C 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷 英文名稱：Aloe emodin -8-O- glucoside 規(guī)格：：HPLC≥98% 10mg/支 保存：：-20℃，避光

白藜蘆-3-O-β-D-葡萄糖苷 英文名稱：Resveratrol -3-O- beta -D- glucoside 規(guī)格：：HPLC≥98% 10mg/支 保存：：-20℃，避光

枸橘甙 英文名稱：Poncirin 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

山柰酚-3-O-蕓香糖苷（煙花苷） 英文名稱：Kaempferol rutinoside (fireworks glycoside) -3-O- 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

非洲防己堿，咖倫明, 非洲防 英文名稱：Palmatine, columbamine Ka Lun Ming, 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

芍藥內(nèi)酯苷 英文名稱：Albiflorin 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

環(huán)氧澤瀉烯 英文名稱：Epoxy Alisma ene 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

利卡靈-B；利卡靈B 英文名稱：Licka Ling Ling B -B; pepole 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

芥子堿硫酸鹽 英文名稱：Sinapine thiocyanate 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

甜橙黃酮 英文名稱：The orange flavone 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過*易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）觀察細(xì)胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。